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pUC57EVL Seamless 試劑盒

簡要描述:

pUC57EVL Seamless 試劑盒公司正在出售的產(chǎn)品:人胃癌細(xì)胞Luciferase熒光穩(wěn)轉(zhuǎn)株 微管蛋白β3(神經(jīng)標(biāo)志物)封閉多肽 飾紋汀蛙虹彩病毒PCR檢測試劑盒 大鼠免疫球蛋白E(IgE)ELISA檢測試劑盒 谷氨脫羧(GAD)活性比色法檢測試劑盒 海濱川西氏菌 免疫球蛋白超家族成員5抗體

更新時(shí)間:2024-01-12

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pUC57EVL Seamless 試劑盒

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pUC57EVL Seamless 試劑盒

20

A-Hc2221

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產(chǎn)品介紹:
區(qū)別于拓?fù)淇寺 A克隆和T4連接隆等常規(guī)克隆方法,無縫克隆技術(shù)可在重組酶的作用下,只需一步反應(yīng),便可將片段克隆到任何載體中的任意位置,得到重組質(zhì)粒。無縫克隆技術(shù)作為一種非常強(qiáng)大的克隆技術(shù),具有快速、簡便、高效、多片段組裝和定向克隆等特點(diǎn),用于單個DNA片段的克隆,多個DNA片段組裝克隆以及多位點(diǎn)突變構(gòu)建等實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/span>
產(chǎn)品特點(diǎn):
1.簡單、快速、精確、定向克隆,連接過程只需要15分鐘。
2.只需要簡單的PCR擴(kuò)增就可以制備片段和載體DNA,不需要內(nèi)切酶、連接酶和磷酸化酶。
3.可以克隆長片段DNA。
4.pUC57EVL線性化載體,經(jīng)特殊處理,零背景。

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PCR基本步驟及注意事項(xiàng)?

一、實(shí)驗(yàn)原理

PCR是體外人工選擇性擴(kuò)增DNA的一種方法,它類似于生物體內(nèi)DNA的復(fù)制。在生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而體外PCR反應(yīng)同樣需要類似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設(shè)計(jì)的特定序列,實(shí)現(xiàn)對特定位置的擴(kuò)增;PCR Buffer提供一個反應(yīng)的緩沖環(huán)境;反應(yīng)過程同生物體內(nèi)一樣,DNA雙鏈打開,引物結(jié)合模板,延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈,而在體外在通過控制反應(yīng)溫度實(shí)現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈,在退火溫度處引物結(jié)合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反復(fù)重復(fù)此過程即可實(shí)現(xiàn)對特定片段DNA的大量擴(kuò)增。到第三循環(huán)開始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子,進(jìn)一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。

在擴(kuò)增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺效應(yīng)。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增,達(dá)到較高水平。因此,應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù),在平臺期前結(jié)束反應(yīng), 減少非特異性產(chǎn)物。到達(dá)平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式,主要包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產(chǎn)物,cDNA等,但不能為RNA。對于不同類型的模板,其主要不同在于預(yù)變性的時(shí)間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預(yù)變性時(shí)間10min足夠,質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預(yù)變性2min、PCR產(chǎn)物預(yù)變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA,但仍可做PCR的模板,只不過在第一輪循環(huán)時(shí)只有一個引物結(jié)合,合成另一條鏈。從第二輪開始,兩個引物均與特異位點(diǎn)結(jié)合,從而實(shí)現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進(jìn)行PCR擴(kuò)增,原因就在于實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)的是DNA聚合酶,只能特意識別DNA鏈。

2.對于模版的量來說,一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜,提取的濃度也往往比較大,為防止?jié)舛冗^大對PCR造成影響,故需對提取的DNA進(jìn)行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴(kuò)增。對于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結(jié)構(gòu)簡單,且提取濃度一般較低,則無需稀釋。

PCR實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準(zhǔn));

2、PCR程序設(shè)置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時(shí)采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸時(shí)采集信號,另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解??赏ㄟ^PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據(jù)試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應(yīng)考慮樣本準(zhǔn)備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復(fù)凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴(kuò)增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴(kuò)增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準(zhǔn)確。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和目的進(jìn)行。

1、擴(kuò)增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進(jìn)行優(yōu)化;引物或探針設(shè)計(jì)不合理, 需要重新設(shè)計(jì);

2、PCR程序不合適, 改用三步法進(jìn)行反應(yīng), 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當(dāng)降低退火溫度; 退火/延伸時(shí)間短(可以在推薦的時(shí)間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產(chǎn)物太長。PCR產(chǎn)物設(shè)計(jì)超過500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進(jìn)行PCR檢測或?qū)⒛0暹M(jìn)行稀釋。

公司正在出售的產(chǎn)品:

兔痘病毒染料法熒光定量PCR試劑盒

程序性細(xì)胞死亡因子4ELISA試劑盒 PDCD4免費(fèi)代測試劑

人膚蠅染料法熒光定量PCR試劑盒

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型膠原交聯(lián)C端肽ELISA試劑盒

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垂體腺苷環(huán)化激活肽受體ELISA試劑盒

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禽腦脊髓炎病毒(AEV)核檢測試劑盒

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抵抗ELISA試劑盒

帕臘南病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

馬巴貝斯蟲探針法熒光定量PCR試劑盒

丁型肝炎病毒抗體ELISA試劑盒

魯氏耶爾森菌PCR檢測試劑盒價(jià)格

驢源性成分(Don)核檢測試劑盒

多巴胺受體D5ELISA試劑盒

擬桿菌屬通用PCR檢測試劑盒直銷

病毒H/H/H亞型(AIV-H/H/H)核檢測試劑盒

二氫嘧啶樣3ELISA試劑盒

毛細(xì)線蟲通用探針法熒光定量PCR試劑盒

闊盤吸蟲通用PCR檢測試劑盒價(jià)格

人鈣轉(zhuǎn)運(yùn)ATP2C型成員1(ATP2C1)試劑盒ELISA

瘧原蟲PCR檢測試劑盒(熒光PCR)

皮諾卡菌PCR檢測試劑盒價(jià)格

人軸突生長誘向因子4(Ntn4)elisa試劑盒

谷芽染料法PCR鑒定試劑盒

埃博拉病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒

人蛋白磷2(2A),催化亞基亞型(PPP2CB)ELISA檢測試劑盒

豬生殖與呼吸綜合癥病毒通用PCR檢測試劑盒

溶血性曼氏桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒

Toll樣受體5(TLR5)ELISA檢測試劑盒

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轉(zhuǎn)基因植物Sad基因PCR檢測試劑盒

人丙型肝炎IgG(HCV-IgG)ELISA試劑盒

偶發(fā)分枝桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒

 


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