商品屬性：

描述：BL21(DE3) Chaprone 感受態(tài)細(xì)胞中含有分子伴侶蛋 白質(zhì)粒，其表達(dá)產(chǎn)物可協(xié)助重組蛋白正確折疊形成可溶活性 蛋白。分子伴侶蛋白質(zhì)粒為抗性（chloramphenicol， Cmr）的表達(dá)受控于四環(huán)素（tetR）操縱子，因此該感受態(tài) 不適用于抗性表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。 本品使用  的化學(xué)感受態(tài)技術(shù)制備， 其室溫可保存 3 天、-20°C 可保存 2 年（推薦保存溫度）、 -80°C 可長(zhǎng)期保存性能無(wú)下降。運(yùn)輸過(guò)程中無(wú)需干冰，可常 規(guī)冰袋運(yùn)輸（推薦運(yùn)輸溫度）。該感受態(tài)細(xì)胞為熱激感受態(tài) 細(xì)胞，轉(zhuǎn)用于蛋白表達(dá)（不可用于克隆和載體構(gòu)建），經(jīng) 42°C 熱激 1min 可獲得 105～106 cfu/μg 效價(jià)，可滿足質(zhì)粒轉(zhuǎn)化要 求。該制品使用簡(jiǎn)單、運(yùn)輸、儲(chǔ)存方便。 

組分
RTS BL21(DE3)Chaprone Competent Cell（10T） 1 瓶
Nano E.coli Transfection Reagent 1 mL
儲(chǔ)存：RTS 系列感受態(tài)為干粉形式，均可室溫保存 3 天，長(zhǎng)期保存-20°C（2 年）。經(jīng) Nano E.coli Transfection Reagent溶解后的感受態(tài)必須分裝后，并于-60°C 以下保存。溶解后的感受態(tài)細(xì)胞避免反復(fù)凍融，在-60°C 以下可保存 6 個(gè)月。
操作方法
1. 從-20°C 冰箱中取出 Nano E.coli Transfection Reagent融化，放置于冰上。取 300 μl Nano E.coli TransfectionReagent 加入到一支凍干感受態(tài)細(xì)胞中，并分裝到 10 支 1.5ml EP 管中（每支 30 μl），于-60°C 以下保存（或立即使用）。
2. 將 10～100 ng 質(zhì)粒 DNA（不可使用連接產(chǎn)物、不可使用篩選標(biāo)記質(zhì)粒）加入到分裝的感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈EP 管（或槍頭輕輕吹打），置于冰上 15min。
3. 置于 42°C 熱激 1 min 后，迅速置于冰上急冷 2 min。
4. 熱激完畢后，向上述感受態(tài)細(xì)胞中加入 450 μL 不含抗生素的 SOC（或 LB）培養(yǎng)基，37 °C 振蕩（225 rpm）培養(yǎng)60 min。使質(zhì)粒上抗性標(biāo)記基因表達(dá)，菌體復(fù)蘇。
5. 取200 μl復(fù)蘇菌液涂布到含相應(yīng)抗生素的LB瓊脂平板表面。（含相應(yīng)質(zhì)粒抗生素和 20 μg/ml ）
6. 將平板置于 37 °C 培養(yǎng)，12~18 小時(shí)后可出現(xiàn)菌落。
7. 挑選生長(zhǎng)良好的菌落，接入 LB 培養(yǎng)基（含相應(yīng)質(zhì)?？股?，20 μg/ml），37 ℃劇烈振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。
8. 1/50 比例接入新的 LB 培養(yǎng)基（含相應(yīng)質(zhì)?？股?，20μg/ml ，0.5 mg/ml L-阿拉伯糖）37 ℃劇烈振蕩培養(yǎng)至菌體密度 OD600 約 0.3（約 2h）。
9. 加入終濃度 2 ng/ml 四環(huán)素（誘導(dǎo) chaprone 伴侶蛋白表達(dá)），37℃劇烈振蕩培養(yǎng)至 OD600 約 0.5（約 2~4h）。
10. 加入適量 IPTG(0.1-1 mM), 15℃振蕩培養(yǎng) 24h（培養(yǎng)搖床無(wú)法制冷條件下，室溫誘導(dǎo) 8～12h）。
11. 4,000 rpm 室溫離心 15 min，收集細(xì)胞，進(jìn)行蛋白表達(dá)和可溶性表達(dá)分析。

PCR基本步驟及注意事項(xiàng)？

一、實(shí)驗(yàn)原理

PCR是體外人工選擇性擴(kuò)增DNA的一種方法，它類似于生物體內(nèi)DNA的復(fù)制。在生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而體外PCR反應(yīng)同樣需要類似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設(shè)計(jì)的特定序列，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定位置的擴(kuò)增；PCR Buffer提供一個(gè)反應(yīng)的緩沖環(huán)境；反應(yīng)過(guò)程同生物體內(nèi)一樣，DNA雙鏈打開(kāi)，引物結(jié)合模板，延伸形成新鏈。而這些過(guò)程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過(guò)控制反應(yīng)溫度實(shí)現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開(kāi)雙鏈，在退火溫度處引物結(jié)合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反復(fù)重復(fù)此過(guò)程即可實(shí)現(xiàn)對(duì)特定片段DNA的大量擴(kuò)增。到第三循環(huán)開(kāi)始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子，進(jìn)一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。

在擴(kuò)增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來(lái)呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺(tái)效應(yīng)。平臺(tái)期(Plateau)會(huì)使原先由于錯(cuò)配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增，達(dá)到較高水平。因此，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺(tái)期前結(jié)束反應(yīng)， 減少非特異性產(chǎn)物。到達(dá)平臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產(chǎn)物，cDNA等，但不能為RNA。對(duì)于不同類型的模板，其主要不同在于預(yù)變性的時(shí)間以及模板的量。一般對(duì)于大的基因組DNA預(yù)變性時(shí)間10min足夠，質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預(yù)變性2min、PCR產(chǎn)物預(yù)變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板，只不過(guò)在第一輪循環(huán)時(shí)只有一個(gè)引物結(jié)合，合成另一條鏈。從第二輪開(kāi)始，兩個(gè)引物均與特異位點(diǎn)結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進(jìn)行PCR擴(kuò)增，原因就在于實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)的是DNA聚合酶，只能特意識(shí)別DNA鏈。

2.對(duì)于模版的量來(lái)說(shuō)，一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng。對(duì)于基因組DNA由于其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，提取的濃度也往往比較大，為防止?jié)舛冗^(guò)大對(duì)PCR造成影響，故需對(duì)提取的DNA進(jìn)行梯度稀釋。否則濃度過(guò)高則可能會(huì)引起非特異性擴(kuò)增。對(duì)于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，且提取濃度一般較低，則無(wú)需稀釋。

PCR實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該注意的問(wèn)題有哪些?

沒(méi)有ct值

檢測(cè)結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問(wèn)題:

1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過(guò)45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準(zhǔn));

2、PCR程序設(shè)置錯(cuò)誤,檢測(cè)熒光信號(hào)的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時(shí)采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸時(shí)采集信號(hào),另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解。可通過(guò)PAGE電泳檢測(cè)引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過(guò)500ng,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)即可), 對(duì)未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應(yīng)考慮樣本準(zhǔn)備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲(chǔ)備,避免反復(fù)凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴(kuò)增基因組DNA;上下游引物Tm值超過(guò)4℃以上也會(huì)影響擴(kuò)增)。

ct值過(guò)晚

在相對(duì)定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對(duì)定量中, 對(duì)低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會(huì)增大, 但是一般不宜超過(guò)40循環(huán), 否則定量不準(zhǔn)確。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過(guò)晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和目的進(jìn)行。

1、擴(kuò)增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進(jìn)行優(yōu)化;引物或探針設(shè)計(jì)不合理, 需要重新設(shè)計(jì);

2、PCR程序不合適, 改用三步法進(jìn)行反應(yīng), 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當(dāng)降低退火溫度; 退火/延伸時(shí)間短(可以在推薦的時(shí)間條件下延長(zhǎng)10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產(chǎn)物太長(zhǎng)。PCR產(chǎn)物設(shè)計(jì)超過(guò)500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進(jìn)行PCR檢測(cè)或?qū)⒛０暹M(jìn)行稀釋。

公司正在出售的產(chǎn)品：